阿胶为马科动物——驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。阿胶的主要成分是胶原蛋白，强脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸，其含量在胶原蛋白中比例固定，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸在阿胶中的含量较高，本实验依据中国药典（2015版），以L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸4种主要氨基酸为指标成分进行含量测定。

1、方法原理    

异硫氰酸苯酯和游离氨基酸可反应生成的PTC-氨基酸衍生物，衍生物在254nm有较强的紫外吸收。衍生后的样品通过色谱柱后各组分得到分离，用紫外检测器检测，用保留时间定性，峰面积外标法定量。

2、主要仪器设备和试剂

a. LC220高效液相色谱仪，带紫外检测器，上海仪电分析仪器有限公司；

b. 电子天平，上海仪电分析仪器有限公司；

c. 超声波水浴；

d. 高温防腐石墨加热板；

e. L-羟脯氨酸对照品、甘氨酸对照品、丙氨酸对照品、L-脯氨酸对照品；

f. 异硫氰酸苯酯(PITC)，色谱纯；

g. 三乙胺(TEA)，色谱纯；

h. 正己烷，色谱纯；

i. 乙腈，色谱纯；

j. 实验用水为去离子超纯水。

3、实验方法

3.1 衍生试剂配制

准确量取125 μL PITC和1.4 mL TEA，分别用乙腈定容至10 mL，摇匀配制成 0.1 mol/L PITC-乙腈溶液和1 mol/L TEA-乙腈溶液。

3.2 对照品溶液的制备

取L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1mL分别含L-羟脯氨酸80μg、甘氨酸0.16 mg、丙氨酸70 μg、L-脯氨酸0.12 mg的混合溶液，即得。             

3.3 供试品溶液的制备

取阿胶粗粉约0.25g，精密称定，置25 mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液20 mL，超声处理（功率500W，频率40kHz）30分钟，放冷，加0.1 mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀。精密量取2 mL，置5 mL安瓿中，加盐酸2 mL， 150℃水解1小时，放冷，移至蒸发皿中，用水10 mL分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25 mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。

3.4 对照品和供试品溶液的衍生化

精密量取对照品溶液和供试品溶液各5 mL，分别置25 mL量瓶中，各加0.1mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5 mL，1mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5ml，摇匀，室温放置1小时后，加50%乙腈至刻度，摇匀。取10mL，加正己烷10mL，振摇，放置10分钟，取下层溶液，滤过，取续滤液，待上机分析。

3.5 高效液相色谱仪参考条件

色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温40℃；检测波长254 nm；进样量5 μL。流动相A：水：乙腈＝20：80；流动相B：0.1 mol/L醋酸钠溶液（pH6.5）：乙腈＝93：7。梯度洗脱程序如下表1

表1 高效液相色谱梯度洗脱程序

时间/min 0~26 26~30 30~31 31~35 35~45

流动相A% 0 0→34 34→54 54 54→0

流动相B% 100 100→66 66→46 46 46→100

4、实验结果

4.1 对照品高效液相色谱图

图1对照品高效液相色谱图

4.2 阿胶对照品的重复性

连续注射6针对照品，计算4种氨基酸峰面积重复性，L-羟脯氨酸RSD为0.77%，甘氨酸0.59%，丙氨酸0.61%，脯氨酸0.61%，重复性良好。

图2 对照品溶液重复性

4.3阿胶供试品高效液相色谱图

图3 供试品高效液相色谱图