阿胶为马科动物——驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。阿胶的主要成分是胶原蛋白,强脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸,其含量在胶原蛋白中比例固定,甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸在阿胶中的含量较高,本实验依据中国药典(2015版),以L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸4种主要氨基酸为指标成分进行含量测定。

1、方法原理
异硫氰酸苯酯和游离氨基酸可反应生成的PTC-氨基酸衍生物,衍生物在254nm有较强的紫外吸收。衍生后的样品通过色谱柱后各组分得到分离,用紫外检测器检测,用保留时间定性,峰面积外标法定量。

2、主要仪器设备和试剂
a. LC220高效液相色谱仪,带紫外检测器,上海仪电分析仪器有限公司;
b. 电子天平,上海仪电分析仪器有限公司;
c. 超声波水浴;
d. 高温防腐石墨加热板;
e. L-羟脯氨酸对照品、甘氨酸对照品、丙氨酸对照品、L-脯氨酸对照品;
f. 异硫氰酸苯酯(PITC),色谱纯;
g. 三乙胺(TEA),色谱纯;
h. 正己烷,色谱纯;
i. 乙腈,色谱纯;
j. 实验用水为去离子超纯水。
3、实验方法
3.1 衍生试剂配制
准确量取125 μL PITC和1.4 mL TEA,分别用乙腈定容至10 mL,摇匀配制成 0.1 mol/L PITC-乙腈溶液和1 mol/L TEA-乙腈溶液。
3.2 对照品溶液的制备
取L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸对照品适量,精密称定,加0.1mol/L盐酸溶液制成每1mL分别含L-羟脯氨酸80μg、甘氨酸0.16 mg、丙氨酸70 μg、L-脯氨酸0.12 mg的混合溶液,即得。
3.3 供试品溶液的制备
取阿胶粗粉约0.25g,精密称定,置25 mL量瓶中,加0.1mol/L盐酸溶液20 mL,超声处理(功率500W,频率40kHz)30分钟,放冷,加0.1 mol/L盐酸溶液至刻度,摇匀。精密量取2 mL,置5 mL安瓿中,加盐酸2 mL, 150℃水解1小时,放冷,移至蒸发皿中,用水10 mL分次洗涤,洗液并入蒸发皿中,蒸干,残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解,转移至25 mL量瓶中,加0.1mol/L盐酸溶液至刻度,摇匀,即得。
3.4 对照品和供试品溶液的衍生化
精密量取对照品溶液和供试品溶液各5 mL,分别置25 mL量瓶中,各加0.1mol/L异硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液2.5 mL,1mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5ml,摇匀,室温放置1小时后,加50%乙腈至刻度,摇匀。取10mL,加正己烷10mL,振摇,放置10分钟,取下层溶液,滤过,取续滤液,待上机分析。
3.5 高效液相色谱仪参考条件
色谱柱:C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温40℃;检测波长254 nm;进样量5 μL。流动相A:水:乙腈=20:80;流动相B:0.1 mol/L醋酸钠溶液(pH6.5):乙腈=93:7。梯度洗脱程序如下表1
表1 高效液相色谱梯度洗脱程序
时间/min 0~26 26~30 30~31 31~35 35~45
流动相A% 0 0→34 34→54 54 54→0
流动相B% 100 100→66 66→46 46 46→100
4、实验结果
4.1 对照品高效液相色谱图

图1对照品高效液相色谱图
4.2 阿胶对照品的重复性
连续注射6针对照品,计算4种氨基酸峰面积重复性,L-羟脯氨酸RSD为0.77%,甘氨酸0.59%,丙氨酸0.61%,脯氨酸0.61%,重复性良好。

图2 对照品溶液重复性
4.3阿胶供试品高效液相色谱图

图3 供试品高效液相色谱图