糖基化修饰的一致性是生物药的关键质量属性，对生物药的功效和安全性至关重要。但由于蛋白质在进行完整质量测定时受到质谱分辨率和质量准确度的限制，生物药糖基化的信息通常局限于在聚糖或糖肽水平获取。依那西普（Etanercept）是恩利（Enbrel®）的活性药物成分，是由人IgG1的Fc部分融合肿瘤坏死因子α（TNF-α受体，TNFR）结构域组成。已有研究通过表征从依那西普中释放的N-和O-糖型，发现依那西普包含多个糖基化位点，是一种高度糖基化的治疗性Fc融合蛋白（图1a）。
该研究中作者采用非变性高分辨质谱来解析依那西普高度复杂的糖基化修饰方式，使用蛋白酶和糖苷酶酶解，整合糖肽、蛋白质亚基水平获得的分子信息以促进部分去糖基化蛋白质水平的糖型注释，最终在蛋白质水平实现特定糖型的分配，用以评估依那西普糖型的异质性。
首先，研究人员使用Thermo Exactive Plus EMR质谱仪，在非变性条件下以100mM乙酸铵水溶液为水相，获得了依那西普完整蛋白的质谱数据（图1b），测得完整依那西普的质量范围为125-131kDa。而根据其氨基酸序列计算得到的理论平均质量为102,160Da，证明对应于蛋白质的聚糖部分的质量约为23,000-29,000Da。
图1. 依那西普的分子结构及非变性质谱图（a.二聚体依那西普由TNFR和Fc结构域组成的示意图；b 完整依那西普的非变性质谱（Rset= 17,500，m/z 200）；d 依那西普用唾液酸酶处理；f PNGase F酶解（Rset = 35,000，m/z 200）；h为PNGase F 与唾液酸酶组合酶解（Rset= 70,000，m/z 200）；c，e，g和i显示的是具有最丰富电荷状态的峰簇的缩放图）
由于依那西普存在大量的聚糖组合，完整的依那西普谱图极为复杂而难以进行糖型分配。因此作者使用糖苷酶、蛋白酶等酶切方法来降低样品的复杂性和分子大小。分别采用以下方法进行处理：（i）用唾液酸酶去唾液酸化；（ii）用肽N-糖苷酶F（PNGaseF）进行去N-糖基化；（iii）前两者的组合酶解；（iv）用唾液酸酶和O-糖苷酶双重消化；（v）通过IdeS酶切将依那西普转化为TNFR和Fc亚基结构域，再用糖苷酶进行处理；（vi）使用胰蛋白酶或胞内蛋白酶AspN酶切成糖肽，然后对所得产物进行质谱分析。具体实验结果如下。
1、除去N-聚糖后测定O-糖型
当使用PNGase F、唾液酸或两者组合酶促消化，去除依那西普的N-聚糖和唾液酸后，所得产物仅为O-聚糖。非变性质谱分析结果表明，与PNGase F /唾液酸酶双重消化相比（图2a），PNGase F处理的依那西普的谱图（图2b）显示出更高的复杂性，这主要由O-糖型的唾液酸化变体引起。因此，基于双糖苷酶消化物检测到的O-糖型质谱响应的相对丰度，可以注释相应O-糖型的唾液酸化（Neu5Ac）变体，如图2所示。
图2. 依那西普O-糖型的注释（a 用PNGaseF /唾液酸酶消化后的依那西普经解卷积处理后的质谱图（原始谱图如图1h所示）；b.用PNGaseF消化后的依那西普经解卷积处理后的质谱图（原始谱图如图1f所示））
2、解析依那西普TNFR和Fc结构域的N-糖型
使用O-糖苷酶去除TNFR的O-聚糖，并与唾液酸酶组合进行酶切，所得峰仅包含缺少唾液酸的N-聚糖变体（图3a）。为了确定TNFR结构域上确切的N-聚糖结构，作者对AspN消化获得的糖肽进行分析，得到位点特异性的N-聚糖数据库，并结合鉴定的糖肽的位点特异性分数，最终将图3a中大多数的峰归属于对应的N-聚糖组合。采用同样的方法可以确定Fc结构域最可能存在的N-糖型结构（图3b）。
图3. 依那西普TNFR和Fc结构域的N-糖基化（a 在非变性条件下获得的唾液酸酶和O-糖苷酶消化的二聚体TNFR解卷积后的质谱图；b 在非变性条件下获得的Fc二聚体解卷积后的质谱图）
3、在完整蛋白水平整合糖基化数据
基于在亚基水平上鉴定的N-聚糖组合，在唾液酸酶/O-糖苷酶处理的依那西普中可以归属去除唾液酸的N-糖型。同理，可以通过整合关于TNFR和Fc结构域的N-聚糖数据来归属唾液酸酶/O-糖苷酶处理的依那西普的其他糖型（图4a）。作者发现，以这种方式进行糖型注释与基于位点特异性N-糖肽数据库中的糖型注释结果一致，验证了在不同消化水平下数据整合的一致性。接着，作者使用相同的方法归属了去除唾液酸残基条件下依那西普中的N-糖型和O-糖型（图4b），最终在蛋白质水平实现了特定糖型的鉴定。
图4. 去除唾液酸的依那西普的N-糖型和O-糖型（a在非变性条件下获得的唾液酸酶和O-糖苷酶处理的依那西普经解卷积后的质谱图；b 在非变性条件下获得的唾液酸酶处理的依那西普经解卷积后的质谱图）
该研究的方法使用较少的样品制备步骤，能够快速获取关于糖型异质性的综合信息，提示我们可应用非变性质谱结合酶解法对糖型进行分析，为高度糖基化生物药物的表征与生物制剂的质量控制开辟了新的途径。
参考文献：
Wohlschlager T , Scheffler K , Forstenlehner I C , et al. Native mass spectrometry combined with enzymatic dissection unravels glycoform heterogeneity of biopharmaceuticals[J]. Nature Communications, 2018, 9(1):1713.
文献整理：朱文文； 编辑：生宁、张金兰；第138期 作者： IMM药物分析 发布：冉盛网
