口蹄疫新型疫苗研究进展
口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病。因其传染性高、传播速度快，故给动物健康和公共卫生带来巨大损失和危害，被列为一类动物疫病。易感动物包括牛、猪、绵羊、山羊和其他野生反刍动物，该病主要症状有发热、食欲不振、跛行和口腔、蹄部、鼻部和乳头等出现水泡损伤等。同时该病的流行和爆发会导致动物生产性能下降、防控措施成本增加和国际贸易限制等巨大的直接和间接经济损失。
FMDV有7个血清型，分别为O、A、C、Asia-1、SAT-1、SAT-2和SAT-3，由于病毒的高度变异，每个血清型还有许多亚型，亚型之间没有交叉保护性，这给预防控制疫病带来诸多困难。目前，在不同国家防控口蹄疫的政策不同，在非疫地区和国家，主要采取扑杀感染动物和易感动物进而净化为无疫区状态的措施，而在疫病流行区主要采取接种疫苗、扑杀感染动物和接触动物、限制易感动物和相关动物产品活动相结合的防控措施。口蹄疫疫苗是开发相对较早的动物疫苗之一，但是由于其病毒高度变异性和多种血清型和亚型的存在，到目前为止还没有一种普遍通用的疫苗。第一种口蹄疫灭活疫苗是从感染牛舌部取水泡液而制成，上世纪50年代用健康牛舌上皮细胞培养病毒；60年代，用BHK-21细胞培养FMDV和引入BEI灭活病毒取得重大突破；70年代将油佐剂引入口蹄疫疫苗生产之中；目前预防口蹄疫的主要措施仍然是接种灭活疫苗。但是，传统疫苗有使用活病毒存在散毒的风险，对厂房生物安全要求级别高，存在灭活不彻底等风险，另外，不能用血清学方法区分接种动物和野毒感染动物。故新型疫苗成为最具有前景的候选疫苗。该综述对口蹄疫新型疫苗的最新研究进展进行总结，其目的在于为进一步研发安全、高效和稳定的新型疫苗提供参考。
一
新型完整病毒标记灭活疫苗
传统灭活疫苗接种动物后产生非结构蛋白成分，不能区分免疫动物和感染动物，从而干扰血清学监测和流行病学调研。故发展一种毒力致弱且能区分感染动物与免疫动物的灭活疫苗得到研究者的青睐。文献表明，FMDV缺乏前导蛋白酶编码区毒力会致弱，同时，这种病毒化学灭活会产生和野毒灭活疫苗一样的免疫效果。2012年，Uddowla等通过对3B和3D进行突变获得具有DIVA（Differentiation between infected and vaccinated animals）特性的FMDV，结果表明，通过用伴随的ELISA检测方法能有效区分感染动物和免疫动物，并进一步与佐剂乳化接种牛，能起到有效的保护作用。2014年，li等人通过敲除3A区域93~143氨基酸序列获得致弱的标记疫苗，结果表明，与野毒株相比，该疫苗的致病力减弱，但能获得10个PD50的免疫效果，同时能有效区分免疫动物和感染动物。
二
合成肽疫苗
传统疫苗虽然能有效控制临床感染，但不能产生一个长效的免疫保护，需要多次接种来维持群体较高的抗体水平。FMDV有VP1、VP2、VP3和VP4结构蛋白，位于病毒颗粒表面的VP1是诱导机体产生免疫应答的主要蛋白，而FMDV亚单位疫苗采用基因工程手段，通过各种表达系统表达VP1蛋白从而制得疫苗。
VP1是FMDV暴露在衣壳外最具有抗原性的区域从而作为蛋白/合成肽疫苗的候选疫苗，这种疫苗不含病毒，易于保存、运输，易于区分感染动物和免疫动物，能有效合成和纯度高等优点，从而引起研究者的关注。1975年，Bachrach等从纯化的病毒中首次分离到VP1，并能在猪体内引起中和抗体。表达VP1蛋白对动物的保护性是有限的，2002年，Wang等将表达的VP1多肽与FMDV T细胞表位结合，结果表明增强了对猪的保护。另外，许多研究者通过合成肽、转基因和病毒载体等方法获得抗原，在这些尝试中，包括一个FMDV T细胞表位和4个拷贝的B细胞表位聚合物在牛体内表现出良好的保护性。2016年，Blanco等设计的2个拷贝的B细胞表位和一个T细胞表位对猪具有完全保护。2015年，Zhang等合成具有免疫原性的位于VP1、3A和3Dpol蛋白的59~87长的氨基酸肽链，该合成肽在单次免疫后对牛具有60%的保护。
三
DNA疫苗
相对于传统疫苗，DNA疫苗表现出一定的优势，生产过程对生物安全要求低、有相对较长的保存期、能快速整合到野毒株上、可以将不同血清型的多个抗原位点共同表达。
最早对DNA疫苗的尝试基于表达空衣壳蛋白，进一步摸索含有活性3Cpro的衣壳蛋白，或利用cDNA编码整个基因组，并在细胞结合位点进行突变修饰，但是这些疫苗都有注射剂量大、需要多次免疫、仅诱导一个低水平的中和抗体反应的缺点。人们后续研究将B细胞和T细胞表位嵌入编码衣壳蛋白的质粒DNA中，结果表明，不但不能达到完全保护，而且出现了比对照组更严重的发病。2011年，Borrego等对B细胞和T细胞表位进行修饰获得部分保护。2013年，Gulce iz等将B细胞和T细胞表位与Bcl-xl抗凋亡蛋白共表达，在小鼠体内T细胞应答有一个较大的提高。Nanda等以糖基化壳聚糖为载体制备DNA疫苗，在猪体内，反应免疫保护的参数都有一个持续性的提高。2011年，Fowler等将VP1 G-H环的13个氨基酸删除获得DNA标记疫苗，接种牛后具有部分保护。
四
在细菌或昆虫细胞获得空衣壳
蛋白疫苗、多肽疫苗或DNA疫苗，通过展示完整病毒粒子上所有构象免疫位点作为免疫原引起动物产生抗体，故应尽可能降低病毒抗原的变异。病毒空衣壳，也叫病毒样颗粒（VLPs），其具有不含核酸、能区分免疫动物和感染动物的能力、由病毒结构蛋白构成、具有自我组装、无感染性和复制能力、能产生有效的体液免疫和细胞免疫应答等特点。FMDV VPLs最初在重组杆状病毒感染细胞中表达，进一步纯化后接种动物，结果表明，在体内能提供一定的免疫保护，但还是达不到灭活疫苗的免疫效果。近年来，研究人员对VLPs的研究越来越多，2013年，Bhat等将O型O-P1-2A和3C编码区重组片段克隆到杆状病毒sf9表达系统，获得重组VLPs后乳化成疫苗接种实验动物猪，结果表明，与传统疫苗比较，该疫苗能引起相对较高的体液和细胞免疫应答，攻毒后能达到70%的免疫保护。2012年，Subramanian等利用FMDV O型毒株获得包含P1-2A-3C编码区的重组杆状病毒克隆，转染到sf9细胞表达FMDV VLPs，与ISA 206佐剂乳化接种实验动物牛，PD50为5.01。2012年，Li等在蚕蛹体内表达FMDV A型Bm-P12A3C空衣壳，结果表明，与FMDV在BHK-21细胞表达相比较，在蚕蛹中表达蛋白的滴度更高，接种实验动物牛后，能引起一个较高的抗体滴度，PD50为4.33。2016年，Li等获得一种FMDV O型和Asia1型嵌合VLPs，结果表明，该新型疫苗对实验动物小鼠和猪引起一个较好的保护性。
与真核表达系统相比较，在细菌内表达异种蛋白对于研究和商业都是一种最简单和最经济的方法。早在上世纪90年代就利用E.coli表达VLPs并对猪有一定的保护性。Xiao等利用10L规模发酵罐，在大肠杆菌中表达FMDV VLPs，接种实验动物牛，能引起一个持续6个月的保护期，PD50能达到11.75。Guo等接种50μg剂量VLPs后能对豚鼠、牛和猪都具有保护性，对牛的PD50达6.34。
除了以上两个表达系统可以获得VLPs之外，还可以利用哺乳动物病毒载体获得空衣壳，病毒载体在感染的宿主细胞表达FMDV VLPs，能引起体液免疫和细胞免疫。目前，用于表达FMDV VLPs的哺乳动物病毒载体有痘病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒属载体和腺病毒载体。许多研究者利用牛痘病毒作为载体表达FMDV衣壳蛋白，但在猪体内都只有部分保护。2013年，Gullberg等在由牛痘载体感染哺乳动物细胞内表达FMDV衣壳蛋白，目前还未在自然宿主体内试验过。2016年，Gullberg等利用一个基于塞姆利基森林病毒（SFV） 的“单循环”包装的RNA载体表达FMDV VLPs，结果表明，该疫苗不能对同种病毒具有保护性。
到目前为止，能有效控制牛和猪FMD的策略是通过人5型缺陷腺病毒载体（Ad5）表达FMDV VLPs，Ad5载体表达A型FMDV衣壳和3C编码区，能对猪和牛起到完全保护。2010年，Grubman等用Ad5表达不同血清型的P1-2A编码区，接种牛后取得较好效果。2008年，Pena等在Ad5-FMD载体中引入2B全长编码区，后者能有效提高FMDV衣壳蛋白的合成，这个改变能增强猪体内特异中和抗体水平。2015年，Medina等Ad5-FMD载体中引入一个额外的RGD基序，这个修饰能增强树突状细胞的转换和牛体内T细胞的反应。
五
总结
目前，预防口蹄疫的主要措施仍然是接种口蹄疫灭活疫苗。但其因具有对生物安全要求高、灭活不彻底造成散毒风险、不能区分接种动物和感染动物的缺点，故探究和研发口蹄疫新型疫苗成为一种趋势。新型疫苗主要是利用基因工程、细胞工程等生物技术手段对病毒、细胞进行改造和优化，使其具有人们期望的毒力弱、抗原性强、抗体水平高、能区分免疫动物和感染动物等特点。故研究者们以FMDV颗粒为研究对象，在不同载体上表达FMDV具有部分或全部抗原性基因片段，表达蛋白与佐剂乳化成疫苗，接种实验动物和自然宿主，观察免疫保护性。
从最新研究进展看，研发的新型疫苗主要将VP1结构蛋白克隆在不同载体，并在原核表达系统或真核表达系统进行表达，接种实验动物或自然宿主，结果显示均能获得部分或较高的抗体水平，伴随的检测方法也能有效区分感染动物和免疫动物。目前，具有应用前景的方法是在大肠杆菌中表达VLPs和在人5型复制缺陷型腺病毒载体中表达FMDV衣壳蛋白。但是，与传统灭活疫苗比较，还存在一定的不足，如需要多次免疫，免疫剂量大、抗体水平低，在自然宿主体内未进行大量试验。故FMD新型疫苗的研制还在一个摸索试验阶段或初级阶段。但是，随着生物技术的发展和在兽医领域不断取得的突破性进展，会加速和推进免疫活性更强、纯度更高、生物安全性更高的FMD新型疫苗，为有效控制和消灭FMD提供新思路和新方法。
生产部 万玉林
编审 李克斌
浅谈猪繁殖障碍性疾病及其综防措施
随着农业现代化的飞速发展，养猪场集约化和规模化的进程也不断加快，但是很多养殖场仍停留在过去传统的养殖模式，普遍存在着管理落后、生物安全意识薄弱、免疫程序不合理、随意从外猪场引种等诸多问题，引起了猪繁殖障碍性疾病的经常性发生。引起猪繁殖障碍性疾病的原因主要是各种传染性疾病，且引起猪繁殖障碍性疾病的病因往往是多因素的混合传染，这些疾病给现代养殖业带来了巨大的经济损失，严重威胁养殖业的健康发展。鉴于猪繁殖障碍性疾病发病情况非常复杂，所以必须快速查明病因，并施以综合防治措施才能有效防控该病。
一
猪繁殖障碍性疾病的分类
能够引起猪繁殖障碍性疾病的因素有多种，主要分为传染性病因和非传染性病因两大类。非传染性猪繁殖障碍性疾病常常由一些生理、理化因素变化所致，传染性猪繁殖障碍的病因主要是指各种动物病毒所致。
1、
非传染性猪繁殖障碍性疾病
常见的病因主要包括先天性猪繁殖障碍性疾病（生殖器官畸形、子宫角异常、实体子宫缺乏等），机能减退性繁殖障碍，人工授精不恰当造成的母猪子宫内膜炎，进而引起母猪发情不正常、屡配不孕、习惯性流产等严重后遗症。另外，集约化规模化的养殖模式，使得种母猪不经常运动，造成脂肪的大量堆积，最后由于母猪过度肥胖而造成繁殖障碍。有时，由于饲料中各营养物质的配比不当，造成饲料中某些必需蛋白质含量过少或者缺失，造成母猪发育不良，体格弱小，进而出现发情期推后和不发情等现象造成的繁殖障碍。
此外，某些微量元素的不足或者过量都可能引起猪体生理、病理性异常。主要是导致一些激素、酶和腺体发生功能性紊乱，进而引起某些机体机能发生异常连锁反应，这些异常反应都可能引起母猪发生繁殖障碍。因此，要监测好母猪机体内微量元素的变化情况，及时补充或减少饲料中这些微量元素的含量。
2、
传染性猪繁殖障碍性疾病
主要的传染性疾病有猪瘟（CSF）、猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）、猪细小病毒病（PP）、猪流行性乙型脑炎（JE）、猪伪狂犬病（PR）、猪附红细胞体病（Eperythrozoonosis）和布鲁氏病菌(Brucellosis)等。母猪感染这些疾病后可能会造成新生仔猪的先天性震颤，个别疾病会引起妊娠母猪的贫血、厌食、精神不振，后期可能会出现更加严重的神经症状。这些疾病多数由病毒感染引起，主要经直接接触、消化道排泄物、污染物等途径进行传播，蚊子、苍蝇等蚊虫叮咬也可造成疾病的传播和蔓延，因此，要严格做好猪场的生物安全、灭蝇除蚊工作，切断传播途径。
二
规模化猪场繁殖障碍性疾病的综合防治
对于非传染性猪繁殖障碍性疾病，一般情况下发生的几率比较小，主要加强种公猪、种母猪的饲养管理水平，根据种猪不同繁殖周期及时给予科学优质的全价饲料，保持相对良好的圈舍通风、保暖、卫生条件，同时搞好猪场尤其是种猪的疫苗免疫程序和猪群疾病监测，实时掌握猪群健康动态信息，科学制定疾病防控措施。
养殖场应高度重视猪传染性繁殖障碍性疾病的发生，应主要从以下几个方面着手，科学管理、综合防控，才能有效的减少疾病，切实提高猪场生产能力和经济效益。
1、坚持自繁自养原则，杜绝疫病传入
养殖场应根据饲养量和出栏量合理储备一定数量的种公母猪，尽可能减少从外引进猪群，防止外源疾病的传入。育种场必须引进种猪时，要在驻场兽医或疫病检验员的正确指导下进行。引种后应隔离饲养15-20天，并进行猪蓝耳病、猪瘟、猪圆环病病毒、猪伪狂犬病等能引起母猪繁殖障碍性疾病的病原体检测，经检测无病原后，才可混群饲养。种猪饲养区、保育区、育肥区之间最好能够实行独立单元式饲养，可有效防止场内不同区域相互交叉感染。
2、实行科学饲养管理，增强疫病抵抗力
针对猪不同发育、繁殖阶段的不同营养需求，选用科学配比的优质饲料，同时，了解种猪正常生长和繁殖在不同阶段的特性，对种猪的饲养管理采取科学多样的方式。不断做好饲料配比要科学和规范化，质量过关，把工作做扎实。同时，加强圈舍的通风性，降低饲养密度，严格控制温湿度。通过这样的科学饲养管理方式，可以增强动物机体的免疫力，大大提高种猪场的生产能力，提高养殖效率。
3、强化消毒工作，切断疫病传播途径
一是对进入养殖场的所有交通工具、器械、人员需通过喷雾消毒、消毒池浸泡、臭氧熏蒸等方式进行严格消毒，防止疫病的传入。二是要高度重视养殖场工作人员自身在疫病感染和传播过程中发挥的作用，对进去场内工作人员应严格控制其活动范围，禁止随意外出，在外出回来后要严格消毒。三是强化对养殖场周围环境、空气的消毒灭虫工作，防止气源性疫病、虫媒传播性疫病的感染和传播。最后，强化定期预防性消毒、灭蝇除虫工作。大型养殖场应严格执行“三天一小消，一周一大消，动物变动及时消”。应选用绿色无污染的高品质、广谱的消毒剂产品，如临洮威特公司生产的高端绿色消毒剂产品：威特格瑞。同时，应注意做好养殖场的消毒记录工作。
4、坚持预防为主、防治结合原则
根据地区疫病流行和本养殖场疫病发生的实际情况，因地制宜、因场制宜，制定科学合理免疫程序和治疗方案。目前，对于病毒性感染引起的猪繁殖障碍性疾病没有特效的治疗药物，因此，加强疫病的免疫预防工作，是养殖场防控猪繁殖障碍性疾病的重中之重。对于猪的繁殖障碍性疾病的疫苗免疫预防，要制定科学适宜的免疫程序，不得随意变更免疫程序。对患病母猪必须要采取药物治疗期间，要综合考量，合理用药，给予病猪一些有利于疾病恢复的舒适环境和饲养管理，同时，强化生物安全防护工作，防止病猪由于免疫力低下进而引起继发感染。
5、加强病原体监测，坚决淘汰病猪或带毒猪
净化病原体是养殖场，特别是种猪场清除疫病最为有效的手段之一，所以必须定期搞好猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪伪狂犬病等病原体和血清学监测工作，坚决淘汰被感染的种猪。最常用的监测手段是：按猪群总量的12%随机采集血液样品，用酶联免疫吸附试（ELISA）进行几种常见病毒的抗体水平检测，做好摸底清查工作，全面动态掌握猪场猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪伪狂犬病的带毒情况。若检测出有带毒种猪存在，要坚决进行淘汰，同时要对剩余的未检测种猪进行全面检测排查，对每次检测出的带毒猪不断地进行淘汰。对于上述病毒的检测工作应每季度进行一次，连续检测四次，直到血清学检测全部是阴性为止。
6、做好无害化处理
舍内排泄物、污染的饲料、饮水要彻底清扫，通过堆积发酵杀灭残余病原微生物，同时对圈舍、器具进行彻底的消毒处理，防止造成进一步的污染。对病死猪、流产胎儿、胎衣等污物要通过烧毁或消毒深埋等方式进行无害化处理。
三
结束语
大型规模化养殖是未来养猪业发展的方向，猪繁殖障碍性疾病的预防与治疗对大型养猪场，特别是种猪场的健康发展和经济效益产生深远影响。大量的生产实践证实，通过上述综合防治措施可以有效控制疫病发生、防止疾病扩散、降低经济损失、提升生产能力。但是，任何一种防治措施都具有其一定的不足之处，因此，养殖人员，特别是驻场兽医要时刻树立科学饲养、强化管理、注重消毒、预防为主、防治结合的综合防治理念，才能实现养殖场健康发展和经济效益的最优化。
提供来源：中农威特生物科技股份有限公司
研发部 张涛
审核 李冬
