文献名称：美藤果油对金黄色葡萄球菌附着于人体皮肤角质形成细胞的影响

　　作者：German Gonzalez-Aspajo,Haouaria Belkhelfa,Laila Haddioui-Hbabi,Genevieve Bourdy,Eric Deharo

　　说明：本文为印奇公司翻译，仅用于交流和学习，如有转载，请不要改动文章格式，务必标明来源。原文在译文的后面。

　　【译文】美藤果油对金黄色葡萄球菌附着于人体皮肤角质形成细胞的影响

　　摘要：

　　与人种药理学相关：美藤果油（大戟科）是一种人工种植的藤本植物，其分布从高海拔的（南美洲）安第斯山地区的雨林到低海拔的秘鲁亚马逊。冷榨的美藤果的种仁油，实际上很受欢迎，其原因在于它富含omega 3和omega 6,因此，也可用作膳食补充剂，其在商业销售中的名称为美藤果油（SIO）。SIO传统上也可用于皮肤护理，以保持皮肤柔软细腻，也可用于治疗伤口，蚊虫叮咬以及皮肤感染，在热带，也可用于皮肤经常损伤的地方。

　　研究目的：由于金黄色葡萄球菌涉及许多皮肤病理学的问题（脓疱疮，毛囊炎，疖和皮下脓肿），本研究的目的是为了证实把SIO用于传统的皮肤护理是否对金黄色葡萄球菌的成长及其对皮肤附着有影响，以证实其是否是皮肤病的一个主要的病原体。因此，我们的目标是评估SIO对人体皮肤外植体和角质形成细胞系的杀菌活性和附着性干预。对细胞的细胞毒也做了测定。SIO的活性与椰油(CocO)进行了比对，椰油广泛用于皮肤护理，但是二者的不饱和脂肪酸含量不同。

　　材料与方法：使用已经鉴定过的油作为实验室材料，确定对放射性标记的金黄色葡萄球菌的抗菌活性。细胞毒作用用XTTon角质形成细胞和人体皮肤外植体上的中性红来进行测度；苯酚作为细胞毒性控制。附着实验通过混合H3标记的金黄色葡萄球菌与角质形成细胞和人皮肤外植体，用油培育2小时之前（用以测定粘附抑制和吸收的预防效应）或生物材料在与金黄色葡萄球菌接触2小时之后（以评估细菌的脱离，吸收疗效）。洗涤后测量剩余放射性有可能确定粘附强度。通过菌落计数在胰酶大豆琼脂测定杀菌效果。

　　结果：实验结果显示，未经稀释测定的SIO和CocO对角质形成细胞、人体外植体没有细胞毒，也不杀菌。作为抗粘附剂，SIO在角质形成细胞上比CocO更具活性。两种油在角质形成细胞上的拆离效果（治疗）并无显著差异，但是SIO对金黄色葡萄球菌从人体皮肤外植体上的拆离效果活性却几乎是椰油的5倍。

　　结论：从该项研究，可以得出如下结论：使用SIO在真皮细胞上对金黄色葡萄球菌的粘附抑制是安全有效的。我们的结果倾向于支持纯SIO在皮肤护理中的传统应用。

　　1.介绍

　　美藤果（大戟科）是一种多年生的木本藤蔓植物，属大戟科。它生长在海拔200至1500m的亚马逊雨林。果实呈星形，种子为暗椭圆形（Dukeand Vasquez,1994）。在西班牙征服西半球之前在秘鲁就有关于它的报道，也有培育人能够证实，从有些墓葬里可以发现有些种子和瓷器一样作为葬品(Brack,1999,2005;Ugent and Ochoa,2006)。

　　经过轻烤或淡煮，其籽可食用，并可作为许多当地食物的组成部分，有时还可与同种植株上的叶子混合在一起食用(Hamaker et al.,1992).

　　种子油（美藤果油）传统上作为日常皮肤护理用油经常使用，其目的是为了保持皮肤柔软、细腻、健康。观察发现，在有些地方，全部种子磨成了粉，加上纯油后成糊状，然后用于皮肤恢复活力之目的（(Brack,1999,2005;Maxwell,1990）。本研究其中一位作者（Gonzalez-Aspajo,个人通讯）注意到，秘鲁亚马逊的实际应用证实，住在印加果种植区的人们(Mariscal Ramón Castilla,Loreto,Maynas,in the Loreto department,and Lamas,San Martin and Bellavista in the San Martin department)在皮肤受损或感染时使用美藤果油，证实了以前当地的一些报道（Correa and Bernal,1989）。

　　美藤果果在Amazonia实际上被认为是一种极具前途的农作物，并在秘鲁和玻利维亚的许多地方都有种植，其果油据说是最富含omega脂肪酸的植物油之一（Chirinos et al.,2013;Guillén et al.,2003）。因此，SIO在欧洲的销售主要是由于其营养特性，还被与其他原料一起被制成膏状日用护肤品（S.I.P.O.,2012）。

　　由于在印加果藤自然生长的地方人们把其用于日常皮肤护理，皮肤受损或感染时的治疗，我们的研究旨在评估SIO活性对金黄色葡萄球菌的作用。

　　在微生物之中，金黄色葡萄球菌是皮肤病的主要病原体。它可能是一些小问题产生的原因，比如：脓疱病，还有严重一些的，比如：皮肤烫伤样综合症，也可诱发危及生命的一些状况，比如：败血症（Krut et al.,2003）。而且，由于金黄色葡萄球菌对于人体角质形成细胞的内化作用，其会导致皮肤持续感染和恶化（Kintarak et al.,2004）。因此，我们通过体外测定角质形成细胞中SIO对金黄色葡萄球菌粘附作用的预防能力（预防作用），以及从角质形成细胞中和人体皮肤外植体中去除金黄色葡萄球菌（治疗作用）。对细胞毒性（对角质形成细胞和人皮肤外植体）和杀菌抗体也进行了评估。

　　2.材料与方法

　　2.1化学

　　AgroIndustrias Amazónicas公司的JoséAnaya提供了特级初榨SIO。此植物油通过认证并具有商业注册号码：RUC 20531294042/RSC1304308N/UIARAA。批号：AI-SM-068。通过冷榨果仁萃取出SIO，然后倒出并通过过滤装置去除杂质。测试用油的脂肪酸构成见表1，在法国图卢兹的MetaToul-Lipidomique中心进行了测定。椰油及苯酚来自西格玛-阿德里奇（Sigma-Aldrich）(C1758,P5566)。

　　2.2.角质形成细胞系

　　人体角质形成细胞系保持在RPMI 1640培养液中，在37℃和含5%CO2湿度的大气环境下，添加10%灭活胎牛血清，1%非必需氨基酸谷氨酰胺，1%谷氨酰胺，1%青霉素和链霉素。48小时后，得到的单细胞层在37℃环境下下用胰蛋白酶-EDTA孵育5分钟后清除。胰蛋白酶随即通过加入10毫升RPMI 1640培养液以及灭活的胎牛血清被灭活。细胞通过离心收集(350g/5 min/20℃)。细胞悬液用锥虫蓝染色试验检查，然后调整到可行的2105细胞/毫升。细胞悬浮液放置在贴壁微孔板。所有化学用品都来自法国布吕马特的杜彻（Dutscher）。

　　2.3人体皮肤外植体

　　所有受试者都同意使用他们的皮肤外植体。12毫米直径的人体皮肤外植体盘EXP001120AK008从法国比奥普雷迪克国际（Biopredic International）获得，放置在放有300μl的MIL207培养液（比奥普雷迪克）的24孔板面上。然后在处理之前，在32℃环境下培养外植体24小时。相较而言，由于皮肤外植体包含皮肤（真皮与表皮）上所有细胞的类型，所以它比孤立的角质形成细胞与实际情况更为接近，所以可发挥其生理作用于组织及邻近细胞（Yasuoka et al.,2008）。

　　2.4.细菌

　　金黄色葡萄球菌CIP 53154培养（2108 cells/mL）被预防注射进10ml的RPMI 1640和MIL207培养介质以及30ml的氚（H3）腺嘌呤(Perkin Elmer)，在有氧条件下在37℃孵育至稳定阶段。为消除不合并放射性，用PBS缓冲液把细菌冲洗3次。（离心2500g/10分钟/5℃）

　　2.5.细胞毒性试验

　　如下文描述，用XTT和中性红测试分别测定了细胞毒对角质形成细胞和皮肤外植体的影响。

　　2.6.XTT测试

　　100μL的胰蛋白酶细胞悬液（1106细胞/mL）放置在平底的96孔微量滴定板上，在37℃用250μl纯SIO,CocO和苯酚（0.5%在培养介质中）孵育2个小时，介质用于控制。然后，50μl XTT试剂加入每一孔并在37℃孵育2个小时。

　　2.7.中性红测试

　　250μl纯SIO,CocO或苯酚（0.5%在培养介质中）在32℃应用与皮肤外植体表面2个小时。然后，在32℃皮肤外植体与0.4%的中性红溶液混合3个小时，用PBS冲洗3次。用1%乙酸-50%乙醇，在550 nm测定光学密度。孵育后，在450 nm测定吸光率。发育能力百分比用下式计算：

　　吸光率百分比=（ODcontrol–ODtreatment）/ODcontrol*100

　　所有实验都做了3次。

　　2.8.杀菌法

　　细菌悬浮液在MIL207中108 CFU/ml与纯SIO,CocO或苯酚（0.5%在培养介质中）v/v混合，在37℃再孵育48小时。然后混合液存放在胰酪胨大豆琼脂培养皿。再在37℃时经过24小时，计算菌落计数，抑制率通过相关控制盘接收无油介质进行计算。

　　2.9.油试法

　　标有H3的金黄色葡萄球菌细菌用PBS清洗1次，重新悬浮于5 ml RPMI 1640介质中。除去RPMI后，在含有5%CO2的大气中，在37或32℃时，在500ml细菌悬浮液中分别放置于角质形成细胞层或人体皮肤外植体。

　　2.10.预防效果

　　角质形成细胞在RPMI1640介质中接收250ml纯SIO,CocO或苯酚（0.5%在培养介质中），然后重新在32℃孵育2小时。外植体及细胞用PBS清洗3次。然后把2108细菌悬浮液加入每个孔（500μl/孔），在32℃孵育2个多小时。然后，用PBS清洗外植体和细胞3次以消除非粘附细菌。

　　2.11.治疗效果

　　500μl/孔的2108细菌悬浮液被加入人体皮肤外植体或角质形成细胞。经过2个小时的接触，用PBS冲洗3次，以除去非粘附细菌。然后用250μl纯SIO,CocO或苯酚（0.5%在培养介质中）来处理外植体或细胞并孵育2个小时。最后，用PBS清洗细胞3次。在预防或治疗的最后，人体皮肤外植体和角质形成细胞接触500μl的裂解液[SDS 0.1%(w/v)in NaOH 0.5 mol/L]并在37℃保持18小时。在500μl细胞混合物中加上裂解液，用β-液体闪烁系统测量放射性（Perkin Elmer,USA）。粘附抑制率通过如下公式计算：

　　[(CPM in control)-(CPM with treatment)*100/（CPM in control）]/CPM:每分钟计数

　　2.12.统计分析

　　控制和油处理组的统计显著差异用单项方差分析法(ANOVA)进行分析，使用XLSTAT软件（Tukey range）P<0.05则认为差异显著。

　　3.结果

　　化学分析（表1）显示SIO中主要的脂肪酸是多不饱和脂肪酸（35%）和亚麻酸（48%）。这些结果与中国关于美藤果油脂肪酸的报道相似，亚油酸（39%）和亚麻酸（43%）(Liu et al.,2014)。

　　与控制组相比，SIO与CocO未显示有抗菌活性，即使在最大剂量（而苯酚杀死100%的细菌）。放弃SIO或CocO对附着效应的假设，可能是由于一种可能的在角质形成细胞或人体皮肤外植体上的细胞毒性的原因，对金黄色葡萄球菌、角质形成细胞和外植体的测试与附着测试的孵育条件相同。SIO挑战之后，多于90%的角质形成细胞和人体皮肤外植体细胞二者都可活。CocO也是无毒的，但只用于测试角质形成细胞。在油暴露后，几乎90%的细菌可活。相反，苯酚杀死了几乎100%的被处理的角质形成细胞和细菌。

　　3.2.前、后粘连抑制试验（表2）

　　3.2.1.前粘连抑制试验（预防）预防效果只在角质形成细胞上进行了测试。纯SIO（几乎40%）从统计上看比CocO（25%）在抑制金黄色葡萄球菌附着于角质形成细胞上更为有效。

　　3.2.2.后粘连抑制试验（治疗）

　　3.2.2.1.在角质形成细胞上。两种油都有能力在100%浓度的条件下把金黄色葡萄球菌从角质形成细胞上除去，效率大约为33%。观察来看，两种油的活性在统计上无意义。

　　3.2.2.2.在人体皮肤外植体上，CocO在外植体上的分离过程无效，而SIO从角质形成细胞和近期萃取的人体皮肤外植体上移除金黄色葡萄球菌的能力相当（在两种样本上大约都是33%）。

　　4．讨论

　　皮肤环境错综复杂，有共生细菌保护皮肤不受致病细菌（金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌，肠杆菌）侵害，并形成临时生物群负责各种各样的细菌性脓皮病（Murakawa,2004）。这些致病菌通过毒力基因产品表达以促进其他细菌附着于并避免从宿主上被清楚以感染病原(Chiller et al.,2001)。对于细菌来说，已经证实其附着过程序列从弱的非特异性与宿主细胞表面的交互作用开始，由细菌和宿主表面的整体理化性质介导，比如电荷和疏水性(An et al.,2000)。附着，允许细菌快速有效附着于宿主细胞是致病细菌与宿主交互作用的主要过程，也在生物膜结构中扮演着至关重要的作用。相应地，生物膜具有特别的理化性质，对药物敏感性具有很强的影响。（Rennemeier et al.,2007）

　　因此，在与传染疾病抗争的过程中，找到能够预防在宿主和病原体上附着的物质是极其重要的。从这个角度来看，因为有报道称SIO可以用于皮肤护理，所以看起来我们研究用SIO来阻止金黄色葡萄球菌附着于隔离的角质形成细胞和皮肤外植体是合适的，同时，与CocO（椰油）相比较也是合适的。椰油广泛用于皮肤护理，但其成分与SIO相比有差异，其饱和脂肪酸（>80%）中几乎没有omega 3 and 6脂肪酸，而SIO中不饱和脂肪酸含量占绝对优势（80%）。

　　研究结果显示，两种油都可以阻止金黄色葡萄球菌附着于角质形成细胞，但是从统计情况来看效果，SIO比椰油更为有效。而且，在此模式下，SIO把金黄色葡萄球菌从人体皮肤外植体上分离的能力几乎5倍于椰油。令人惊讶的是，在从角质形成细胞上把金黄色葡萄球菌移除能力的问题上，两种油并无差异（两种油的除去移除细菌的量都在30%左右）。据我们所知，在最小移除百分比的效果上没有相关文献可供参考，因此本研究是首次对此进行检验的。因此，需要用活性测试来确认使用SIO的好处。

　　虽然，有研究证明皮肤的脂肪对金黄色葡萄球菌有抗菌能力（Burtenshaw,1942;Drake et al.,2008），并且皮肤脂肪酶参与生产短链脂质(Verallo-Rowell et al.,2008)，由于两种油对金黄葡萄球菌并不产生任何有毒效应，所以，我们观察到的分离效果不可能与两种油的任何直接的细胞毒性效应相关。

　　不饱和脂肪酸比如亚油酸（在高浓度的SIO中），可增加金黄色葡萄球菌的膜流体性，干扰微生物粘附与皮肤（Arsic et al.,2012），并可在蓝藻膜室诱导类囊体的净负面电荷密度显著增强，从而影响细胞表面电荷和疏水性（Doltchinkova and Nikolov,1997）。使用椰油时，其主要成分十二酸，从观察效果来看，可起到部分分离的效果，因为它可以抑制金黄色葡萄球菌和蛋白表面的传导信号（Clarke et al.,2007;Ruzin and Novick,2000）。

　　也有观察认为，比如Leug的文章（2008），过敏性皮炎病人的皮肤上金黄色葡萄球菌附着增加，这被认为是与皮肤底层的特应性皮炎炎症相关。由于长链多不饱和脂肪酸常与抗炎症特性联系在一起（Mullen et al.,2010），因SIO多不饱和脂肪酸含量较高，所以作为有效补充，值得在局部应用（指药剂生实验室施用）上给予SIO特别考虑。

　　据我们所知，在相关的文献中并无有关最小脱离百分比的有效术语可供参考，但是在急性期金黄色葡萄球菌的密度可达每平方厘米107个微生物，特别是散播性神经性皮炎，30%的脱离对于病人来说已经非常好了。针对此病理，经典的治疗方法是使用糖皮质激素（降低炎症）和抗生素。然而，长期使用糖皮质激素可导致由金黄色葡萄球菌自身而引导的抗免疫抑制效应的出现。

　　而且，糖皮质激素对皮肤的影响是多方面的，包括皮肤萎缩、微血管扩张、皮肤肤色变化（Coondoo et al.,2014）等。包含SIO的外用非类固醇研究就非常有趣，因为维护治疗与急性外用糖皮质激素相关。在活性测试中，很显然是要求确认此论断的。

　　脂肪酸作为组织的一般成分，可以预计他们不会带来刺激或致敏，而外用外源性化合物类则会产生刺激或致敏。

　　最后，在早期的研究中，Zurita and Hay(1987)对脂肪酸的附着效应提出建议，它可以是在皮肤癣菌孢子和人体角质形成细胞之间的一个调节因子。因此，测试SIO对霉菌病的活性就很有意义，因为皮肤霉菌病是世界上与健康休戚相关的一种病，特别是在热带地区（Lupi et al.,2005）。

　　结论：在由葡萄球菌引起的皮肤附着问题上，我们首次强调了SIO在预防与治疗两方面的相关性。我们的研究结果倾向于支持纯SIO对皮肤护理的传统使用上。分馏和鉴别最有效的抗粘附脂肪酸，可对特定的皮肤感染问题提供新的、安全的和低成本的治疗或预防策略。Omega 3–6可起到，至少部分起到对人体皮肤外植体上的脱离效果，但是，明显尚需深入的试验来确认这一假设，在如何起到最好抗附着效应上，也需确定omega 3–6的最优比例。

　　【原文】Sacha Inchi Oil(Plukenetia volubilis L.),effect on adherence of Staphylococus aureus to human skin explant and keratinocytes in vitro