分享:病毒研究与抗病毒药物研发的经典实验及其重点仪器

作者:冉盛网 时间:2020-03-13 15:09:45

从全国疫情数据看,截至目前,除湖北外,所有省份地区现存确诊均低于500人。疫情是否得到控制我们还得听专家们的,而多地连续多天的零增长,让我们看到战疫继续向好拓展,着实如这周广州的天气一般给人带来热切的希望,正如我们之前的专题所说“没有一个冬天不可逾越”,春天正慢慢到来。但关键时候大家可不能掉以轻心!!随着陆续复工复产,小编提醒各位必须做好个人防护消毒工作,戴好口罩,因“疫”思变,化危为机,很快我们就能看到彼此间如春天花开灿烂般的笑容!

战疫态势逐步趋好,有赖于联防联控机制和有效的诊疗方案出台,2月19日下午,卫健委印发了《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》,在这一版的方案中,增加了两款抗病毒试用药物——磷酸氯喹与阿比朵尔。

 



磷酸氯喹原本是一种作为治疗疟疾和自身免疫性疾病的老药,在临床上的应用已经有70多年的历史,专家通过老药新用的研究路径发现它对治疗新冠病毒有一定临床效果,因此该药多次在国务院联防联控机制发布会上受到推荐。

另一款纳入诊疗方案的药物阿比朵尔是一种广谱抗病毒药物,在中国工程院院士李兰娟团队对其进行的体外实验中发现,该药对新冠病毒有抑制作用。

也许,在我们还没来得及分辨出哪种药物才是有确实的疗效前疫情已得到有效控制,也不管新冠肺炎将来是否存在转变成慢性疾病,或像流感一样与人类共存的概率,可以肯定的是,针对其治疗药物和疫苗的研发,已势在必行。




 

特效药之梦
 

自03年SARS爆发后,国内外就从未停止SARS药物及疫苗的研究,加上之后的MERS出现,国际上更是加大了对冠状病毒药物的研究力度,虽然期间有一些候选药物,但依然没有所谓的特效药。在国际上到目前为止,抗病毒药物的研发还算处于初级阶段,大多数的病毒都没有特效药物。看来,抗病毒药物研发至上市真可谓路漫漫其修远兮......


 

病毒研究及药物研发的经典实验
 

在病毒研究和抗病毒药物的研究,通常都包含着几个经典实验:
 


 

细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)
 

通过光学显微镜观察研究病毒在敏感细胞内增殖引起的细胞病理改变。
 


 

病毒蚀斑实验(Plaque assay,PFU)

将稀释的病毒悬液加入单层细胞中,病毒吸附后再覆盖一层融化的半固体营养琼脂,使病毒在单层细胞培养中有限扩散,最终每一个有感染性的病毒在单细胞中可产生一个局限性的感染灶,结合活性染料染色,活细胞着色,受病毒感染破坏的细胞不着色,形成肉眼可见的蚀斑。借此实验可以检查并准确滴定病毒感染性。


 

TCID50法
 

一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释后分别接种细胞,经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等指标,以最高稀释度能感染50%细胞的量为终点,最终统计测定出病毒能使50%的组织培养细胞发生感染的最小量。


 

免疫染色法
 

病毒感染靶细胞后会表达病毒所编码的蛋白并产生荧光信号,利用荧光显微镜进行图像捕获,分析病毒的感染效率。


 

就在前些日子,有超过100篇有关新型冠状病毒的文献发表在各大期刊杂志上,新型冠状病毒及针对其药物研究成为了科学研究热点。其中我们看到一篇发表在Cell Research上题为

《Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emergednovel coronavirus (2019-nCoV) in vitro》(瑞得西韦和磷酸氯喹能在体外有效抑制新型冠状病毒(2019-nCoV))

的论文。


 

在论文中,研究人员根据冠状病毒侵入人体的机理选出了7种当前已获批上市的抗病毒药物,先通过CCK8分析确定候选化合物在vero E6细胞中的细胞毒性,然后用相同的病毒感染复数(MOI)感染后的vero E6细胞测试不同浓度的测试药物,感染细胞期间通过使用荧光定量PCR检测细胞上清的病毒拷贝数来评估细胞的感染效率,最后在使用病毒感染细胞48H后通过荧光染色法观察药物对病毒的抑制效果。


 

该研究得出结论,通过CCK8分析出各个药物对细胞的半数毒性浓度(TC50)和药物的半数抑制率浓度(IC50),最终得出各种药物的选择指数SI(选择指数(SI)为TC50/IC50)。选择指数(SI)是作为判断药物效果的安全范围的一个数值,选择指数大于1.00以上为有效,指数越大安全范围越大。


 

根据SI研究者分析出了瑞得西韦(Remdesivir, GS-5734)和磷酸氯喹(Chloroquine)最为有效,在vero E6细胞上,瑞得西韦对2019-nCoV的半数有效浓度EC50=0.77 µM(微摩尔每升),选择指数SI大于129;磷酸氯喹的EC50=1.13 µM,SI大于88,说明上述两种药物在细胞水平上能有效抑制2019-nCoV的感染,但其在人体上的作用还有待临床验证。

研究者再根据选出的两种药物及分析出的数据进行了免疫荧光的实验,进一步印证了,两种药物在细胞水平上能有效抑制2019-nCoV的感染。

(注:WHO于2020年2月11日宣布将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”,上文为与论文题目保持一致,保持用旧名“2019-nCoV”,方便大家阅读理解)

 

研究实验中的重点仪器
 

完成一个项目的课题往往需要大量的实验,刚刚分享的这篇论文里,尽管实验项目相对较少,但里面也包含了酶标仪、荧光定量PCR仪、荧光显微镜、正置光学显微镜等。
 


 

But实验室空间有限,安置仪器麻烦,加上实验时间跨度大,无法分身做其他事情。。
 

实验下来,手上拿着庞大的实验数据,分析起来耗时耗力,怎么办???

内容提供来源:皇河仪器 (内容有缩减)  ,快速使用更多仪器