亲和色谱法
亲和色谱法作为液相色谱法的一个分支，在60年代以后获得了迅速的发展，它可在实验室和工业制备规模上，用于分离、纯化具有不同分子量的生物活性物质，如氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核苷、核苷酸、核糖核酸和脱氧核糖核酸等。
亲和色谱法与其他液相色谱法比较，其突出优点是可对天然生物活性物质进行高特效性的分离和纯化，具有高的浓缩效应，可从大量样品基体中分离、纯化出所希望获取的少量生物活性物质。这种特效性产生的原因，是由于在亲和色谱固定相基体上，键合联接了具有锚式结构特征的配位体。此配位体的官能团与被分离的、结构相似的生物分子之间，存在特殊的、可逆的分子间相互作用，依据生物识别原理，可以简单的步骤，实现生物样品组分的高纯度、高产率的分离。
70 年代末期由于新型高效固定相基体的采用，又发展了高效亲和色谱技术，并已在生物化学、分子生物学、生物工程、基因工程中用于生物活性物质的常规分析，而且显示出愈来愈重要的作用。
分离原理
（一）锁匙结构络合物的生成
亲和色谱固定相上键合的配位体与被分离的生物活性分子之间的相互作用，可用锁匙结构络合物（Lock - and - key - Structural Complex）的生成来表示，如图6-2-1所示。生物活性分子与配位体间存在着特异、可逆性的相互作用，这种专属性涉及分子间的范德华力、疏水作用力、静电吸引力、络合作用力及空间位阻效应等多种因素。
在一定温度、pH 值和离子强度的条件下，锁匙络合物BL存在下述离解平衡：
式中，B 为被分离的生物活性分子，L 为固定相上的配位体。
［B］、［L］和［BL］皆为平衡浓度，Kc为络合物的离解常数。
（二）亲和色谱法的分类
自60年代至今亲和色谱法已获得巨大的进展，依据生成锁匙结构、可逆络合物机理的不同，已发展了多种方法，如表6-2-1所示。
表6-2-1 亲和色谱法的分类
固定相
由图6-2-1 已看到亲和色谱固定相是由基体（Matrix）、间隔臂（Spacer Am）和配位体（Ligand）三部分构成，以下分别介绍各部分的组成。
（一）基体
亲和色谱中使用的基体材料可分为天然有机高聚物、合成有机聚合物和无机载体材料三类。此外基体在偶联间隔臂之前还需进行活化预处理。
作为亲和色谱的基体材料应具备以下条件：
①具有一定的刚性、挠性和机械强度；
②具有在一定,5 值范围的化学稳定性，不溶于普通试剂；
③表面具有一定的活性官能团，如羟基、胺基、醚基等，可被适当的试剂活化。
当使用基体材料时，还应了解它们的基本物理性质，如粒度、表面积、相对密度、孔径和孔容等必要的参数。
1. 基体的分类
（1）天然有机高聚物
亲和色谱早期使用的基体材料主要是由天然有机高聚物制成的软质凝胶，具有三维晶格结构或多孔网络结构，凝胶内未被骨架占据的空间含有截留的液体，使其保持柔软。凝胶颗粒呈均匀的球形，具有一定的机械强度，并具有化学惰性，常用的凝胶材料为：
①葡聚糖（Dextran） 它是由葡萄糖分子以α-1,6 键相连、具有空间网状结构的聚合物，分子量大于)+*。市售Sephadex G(Pharmacia，瑞典），是由精制葡萄糖与交联剂环氧氯丙烷交联共聚制得的球状聚合物。0 值表示不同的交联度，G值愈大，孔径愈大，G后边的数字还表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍，如0—56 表示每克干胶可吸附水2.5g。Sephadex G 型的物理性质和应用范围见表6-2-2，其中,Sephadex G-200是理想的适用于分离细胞组织的亲和色谱基体。Sephadex G 可耐受110℃高温和0.5mol/L NaOH 溶液处理，其骨架上众多的羟基可以活化用于偶联其他化合物。
葡聚糖①和Sephadex②的化学结构如下：
①琼脂糖（Agarose） 它是由D-半乳糖和3，6- 脱水 -L- 半乳糖交替连接的链状多糖，糖链间通过氢键形成稳定的多糖螺旋束网状结构，其化学结构如下：
表6-2-2 葡聚糖 Sephadex G 型主要物理性质和应用范围 (略）
琼脂糖凝胶是亲水、疏松的，分子量超过78+ 的生物大分子可自由进出凝胶颗粒。它具有良好的化学惰性，可在0-40℃和pH=4-9 的条件下使用，不发生离子交换，对生物大分子仅产生很低的特异性吸附。它的机械强度高于葡聚糖，分离蛋白质的分子量范围可达10^8。
琼脂糖凝胶的不足之处是它不宜干燥和反复膨胀使用，若长期保存应添加无害的抑菌剂（0.2%叠氮钠、甲苯），并在8℃以下不结冰的环境下保存，若冰冻会导至凝胶球的结构产生不可逆的破坏。
琼脂糖凝胶的商品型号为Sepharose（Pharmacia，瑞典）和Bio GelA（Bio-Rad，美国），近来使用2，3 ) 二溴丙醇作交联剂制得的Sepharose CL（Pharmacia，瑞典）可经受110-120℃高压灭菌处理，在pH-3-4介质中使用，其稳定性大大提高，可用含高浓度脲、盐酸胍、有机溶剂和非离子型表面活性剂的流动相进行洗脱。常用的琼脂糖商品性能及应用范围见表6-2-3。最新报道的将琼脂糖先与含多环氧基长链交联剂（如聚乙二醇）进行交联，然后再用短链交联剂（如2，3- 二溴丙醇）进行第二次交联，可制得凝胶商品为Superose,，它的机械强度和化学稳定性进一步提高，当用0.1mol/L HCL及0.1mol/L NOaoh在40℃处理14天后，色谱性能无明显改变，并能承受70%甲酸及30%乙腈的处理，它可作为高效液相亲和色谱的基体材料。
表6-2-3 琼脂糖商品性能及应用范围(略）
（2）合成有机高聚物
在亲和色谱中使用的合成有机高聚物，其表面应具有亲水性，且粒度均匀，具有多孔或非多孔结构，可分为以下几种类型的高聚物。
①聚丙烯酰胺及其衍生物聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺、交联剂N，N- 亚甲基二丙烯酰胺，在引发剂N，N，N'，N'- 四甲基乙二胺和过硫酸铵存在下聚合而成，它为具有网状结构的凝胶，其制备反应如下：
常用商品型号为BioGel P（Bio-Rad，美）软质球形凝胶，其中P表示交联度，P 值愈大表示交联度高，其孔径也愈大。它可在pH=2-10的介质中使用，有较好的化学稳定性，其主要优点是具有大量可修饰的酰胺官能团，可用多种方法进行偶联反应；不足之处在于机械强度较差，网孔小，不宜用作生物大分子的分离。表6-2-4为Bio-Gel P 型商品的主要性能和应用范围。
表 6-2-4 聚丙烯酰胺商品性能及应用范围(略）
聚丙烯酰胺——琼脂糖共聚物Utroggel（LKB/，瑞典）是一种新型聚合物，它具有聚丙烯酰胺的三维晶格，其空隙内又含有琼脂糖凝胶，并具有可功能化的酰胺基和羟基，粒度为60-140μm，机械性能较强，比常用的凝胶基体耐压，可在较高流速下操作，表6-2-5列出Utroggel的技术规格。
由N，N'-亚甲基二丙烯酰胺与丙烯基葡聚糖共聚生成的Sephacryl（Phamarcia，瑞典）硬质凝胶，粒度25-75μm，可在pH=3-11 介质中使用，于120℃、pH=7 的环境中消毒。它用0.2mol/L NaOH室温处理100h，凝胶的多孔性和流速无变化，并可用含6mol/L 盐酸胍和十二烷基磺酸钠（SDS）的流动相进行洗脱，Sephacryl-2-6系列性质见表6。
表6-2-5 Utrogel的技术规格(略）
表 6-2-6 Sephacryl凝胶系列的性质(略）
以N- 丙烯酰基 -2- 氨基 -2- 羟甲基-1,3- 丙二醇为单体，以N，N'- 二乙烯基酒石酸二酰胺为交联剂，聚合生产的Trisacryl（IBF Biotechnics,法）凝胶，具有良好的亲水性、低的非特异性吸附，良好的机械性能和化学稳定性，可在pH=1-11介质中使用，可耐受变性剂和有机溶剂，并具有抵抗微生物侵蚀能力，其骨架主链上的羟甲基官能团可用多种方法活化，它对配位体蛋白质的键合容量高于琼脂糖基体，现已获愈来愈广泛的应用。
②甲基丙烯酸酯共聚物聚甲基丙烯酸羟乙酯是由单体甲基丙烯酸-2- 羟基乙酯（HEMA）与交联剂二甲基丙烯酸-1,2- 亚乙基酯（EDMA）共聚生成的、具有刚性网状结构的疏水球状颗粒，粒径10μm，有良好的机械强度和化学稳定性，在pH=2-13介质中使用，可耐2mol/L HCL或NaOH清洗，加热至170℃进行高压灭菌而不分解，它富含羟基可用多种方法活化，可作为高效液相色谱固定相使用。另一种聚甲基丙烯酸缩水甘油酯是甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、季戊四醇二甲基丙烯酸酯（PDMA）和聚乙二醇（PEG）三者的共聚物，具有良好的机械强度和化学稳定性，粒径10μm，可在pH=2-12介质中使用，可耐受脲、盐酸胍、有机溶剂的处理，此凝胶富含醇羟基和醚基，可用多种方法活化，常用于高效亲和色谱的是TSKToyopear(Toyo Soda Corporation，日）HW-65F凝胶。
③脲醛树脂在1，2- 丙二醇介质中，尿素与甲醛在硝酸铁催化剂存在下，40℃行缩聚反应4h，可制得单分散非多孔微球，粒径约2-4μm，可在pH=1-13 介质中使用，显示良好的机械强度和化学稳定性，脲醛树脂微球表面的酰胺基团可用多种方法活化，已作为高效亲和色谱固定相的基体。
④高交联度苯乙烯 - 二乙烯基苯共聚物交联度达40%-90%的苯乙烯——二乙烯基苯共聚制得的全多孔微球，粒度10-40μm，孔径30-100nm，它是在80年代以后采用种子聚合法制成的新型基体材料，可在pH=1-14的介质中使用，具有良好的机械强度和化学稳定性，可直接作为高效反相色谱固定相使用，其表面呈强疏水性，可经磺化或氯甲基化反应后，偶联适当的间隔臂和配位体，并已在高效亲和色谱中获得愈来愈多的应用。
应当指出由高交联苯乙 -二乙烯基苯共聚物制得的灌注色谱固定相——POROS（PerSptiveBiosystems，美），开辟了对生物大分子分离的新途径，它在10-20μm 的球形颗粒上，制备出具有600-800nm 的贯流大孔并与80-150nm 的渗流小孔相沟通的特殊网络结构，可在广泛的*; 值范围、低柱压下实现生物大分子的快速分离。此类填料经磺化或氯甲基化处理后，也可用于制取高效亲和色谱固定相。
近年还研制出高交联度苯乙烯 - 二乙烯基苯非多孔共聚微球，其粒径仅2-5μm，可装填于φ4.6mm*5cm的短色谱柱中，也可实现生物大分子的快速分离。
（3）无机载体材料
现在高效液相色谱中广泛采用的无机载体材料是Sio2，其中粒径5-10μm、孔径30-100nm的全多孔Sio2微球，在高效亲和色谱中使用较多，近年为实现生物大分子的快速分离，也逐渐使用2-5μm非多孔Sio2微球。
80年代末期不少色谱工作者已探讨使用机械强度高、在广泛pH值范围内稳定的ZrO2、Tio2、CeO2和Wo3作为高效亲和色谱的新型载体，并研制成功全多孔微球和非多孔微球的制造方法，已取得可喜的成果。
2. 基体材料的活化——功能化反应和偶联反应
前述各种基体材料皆需进行活化处理后，才能与间隔臂联接，各种活化基体的方法如下：
（1）无机载体材料的活化
①活化方法以Sio2为代表的无机载体材料，经盐酸处理后，其表面含大量硅羟基，此羟基可与活化试剂——硅烷偶联剂反应，使基体功能化，而成为表面联接有反应活性官能团的活化基体。如经盐酸处理过的Sio2与γ-氨丙基三乙氧基硅烷进行的活化反应为：
表 6-2-7 常用硅烷偶联剂(略）
（2）合成高聚物基体的活化对聚丙烯酰胺基体可用含双官能团的活化试剂，如戊二醛、乙二胺、N-羟基丁二酰亚胺等来进行活化，活化反应如下：
对苯乙烯- 二乙烯基苯共聚物，常用氯甲基化反应、磺化反应、硝化反应进行活化，活化反应如下：
（3）多糖聚合物的活化
琼脂糖、葡聚糖均含有大量羟基，可与含亲电子基团的活化试剂，如溴化氰、环氧氯丙烷、二乙烯基砜、丁二酰氯等反应，进行活化，活化反应如下：
（二）间隔臂
在亲和色谱固定相中，需通过间隔臂将配位体联接在基体上，由于间隔臂占据一定的机动空间，当配位体与被测定的生物分子（尤其是生物大分子）产生亲和作用时，有利于克服存在的空间阻碍作用。
当粒度小、孔径小的基体联接小分子配位体时，或当大分子配位体比较密集地分布在基体上时，其与被测定生物分子的亲和作用，会受到空间阻碍作用的影响。为了克服空间阻碍作用，并实现配位体与被测定生物分子间最佳的相互作用，必须解决如下两个主要问题。
1. 间隔臂长度的选择
关于间隔臂的长度，经过前人大量实践经验已经确定，对低亲和能力的配位体或当作用物为生物大分子（蛋白质）时，在基体和配位体之间的间隔臂长度约为2-12个原子的距离。为获得最佳的亲和作用，它们之间需插入4-6个亚甲基的桥键。对具有高亲和能力的配位体或当作用物为表观分子量低的生物分子时，对间隔臂长度的要求就不如上述系统那样严格。
2. 用作间隔臂的化合物的选择
对用作间隔臂的化合物，文献上推荐使用具有NH2(CH2)nr 通式的ω-氨烷基化合物。通式中R可为羧基、羟基、胺基或配位体自身。此类化合物分子中含n 个亚甲基（—CH2—）疏水性基团。
具有疏水性基团的间隔臂分子会与配位体或作用物生物分子之间产生非特异性吸附作用，干扰配位体与生物分子间特效性的锁匙相互作用，为消除非特异性吸附，可在沿间隔臂分子的长轴方向的某些原子上偶联亚胺基（—NH2—）、羟基（—OH）等官能团，以破坏单一的疏水区域，增强亲水性。
显然，当使用亲水性强的间隔臂分子来代替疏水性间隔臂分子时，会显著降低对锁匙特效亲和作用的干扰。有些亲和色谱分离实例还表明，当存在少量非特异性吸附现象时，亲和色谱分离却会得到最有价值的分析结果。因此在亲和色谱分析中，仔细控制特效性亲和作用和非特异性疏水作用的平衡，会比完全消除非特异性吸附作用更有利。
间隔臂分子长度的选择，可依据前述惯例或依据制备的难易程度加以考虑，只要获得最佳分离效果，就不必再增加臂长。间隔臂过长，会因挠性引起折叠或缠绕，也会使能与生物分子作用的配位体密度减小，并增加非特异性吸附或降低色谱柱柱效。
用作间隔臂的化合物结构，与活化基体时使用的活化试剂相似，皆为含有双官能团的化合物，其分子一端与活化基体联接，另一端将与配位体偶联。
可作为疏水性间隔臂的有机化合物有：
作为亲水性间隔臂的有机化合物有：
④小肽类 如，由两个甘氨酸和一个赖氨酸缩合的三肽，
在实际使用中应根据亲和色谱分离目的的不同而恰当的采用疏水性或亲水性间隔臂。
（三）配位体
在亲和色谱固定相上键联的配位体，可为染料配位体、定位金属离子配位体、包合配合物配位体、生物特效配位体、电荷转移配位体和共价配位体，以下分别予以阐述。
1. 染料配位体
三嗪活性染料为主要使用的染料配位体（Dye Ligand），此类染料分子的结构与生物酶的天然底物相似，故可与酶或蛋白质的活性作用点结合而用于亲和色谱。
氯原子被取代基依次置换后，其化学活性显著下降。当反应温度为0-5℃时，第一个氯原子可被置换；当反应温度为40-50℃时，第二个氯原子可被置换；第三个氯原子需加热90℃以上才可被置换。
三嗪活性染料产品主要为瑞士汽巴8 嘉基公司（Ciba-Geigy）生产的$-9/;<=0系列和英国帝国化学工业公司（ICI）生产的Procion系列。它们可分为三种不同类型的产品，即二氯三嗪型、一氯三嗪型和一氟三嗪型。
我国不少染料厂也生产与Cibacron和Procion系列相近似的产品，可从染料应用手册查找对应的型号。常用三嗪染料分类如下：
D——染料母体，可为蒽醌，萘（萘酚），吡唑酮的磺酸盐；
R——苯磺酸盐
最早用于亲和色谱的染料配位体是蒽醌一氯三嗪活性染料Cibacron Blue F3G-A，其结构分为四个部分。
Procion Blue MX-R相当于国产染料活性艳蓝x-BR）是另一种常用的染料配位体，它为蒽醌二氯三嗪染料，化学性质比Cibacron Blue F3G- A 活泼，其结构分为三个部分。
在Sio2基体上键合活性艳蓝x-BR 配位体的反应过程，如下：
生成的染料配位亲和固定相可用于人血清白蛋白的纯化，还可用于核碱的分离。
2. 定位金属离子配位体
定位金属离子配位体（Immobilized Mstal Ion Ligand）是将具有螯合作用的有机官能团键合在偶联间隔臂的基体上，然后与Cu2+ 、Zn2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+ 等金属离子生成稳定的螯合物，利用螯合物中定位的金属离子与生物分子的特效亲和作用实现生物分子的分离或纯化。常用的有机螯合剂，如亚氨基二乙酸（IDA），亚胺基二乙醛肟（IDAO），硫脲，吡啶咪唑、打萨宗、8 - 羟基喹啉等，都可键联到亲和色谱基体上。现以将亚氨基二乙酸键联到苯乙烯 - 二乙烯基苯共聚物基体或硅胶基体上为例，说明其主要反应过程。
（1）IDA 键合到苯乙烯 - 二乙烯基苯共聚物基体上苯乙烯 - 二乙烯基苯共聚物基体首先进行氯甲基化反应。氯甲基醚可由甲醇、甲醛与氯磺酸反应产生，并立即与共聚物基体反应，再与IDA 偶联，反应过程如下：
（2）IDA 键合到硅胶基体上经盐酸处理后的硅胶，被 γ- 氨丙基三乙氧基硅烷活化，联接间隔臂氯代环氧丙烷后，再与IDA偶联，反应过程如下：
稳定的螯合物。此螯合物中的上述金属离子与生物分子产生特效亲和作用，可用于核苷、核苷酸、酶、蛋白质的分离。
3. 包合配合物配位体
包合配合物配位体（Inclusion Complex Ligand）是由主体（Host）分子与客体（Guest）分子间的特殊亲和作用而形成的。常见的主体化合物的共同特点，是都具有环状或穴状大分子结构。客体分子（包括生物分子）可被包合在主体分子的环内或穴内而形成包合配合物。常用的主体分子为β- 环糊精、冠醚与穴醚、杯环芳烃，它们的结构和特点如下述：
（1）β- 环糊精（β- cyclodextrin,β- CD）
环糊精为环状低聚糖的总称，其α、β、γ、δ- 环糊精分别由6、7、8、9 个葡萄糖单元，以1，4- 糖苷键相连接，分子形状似截去顶端的圆锥形，分子结构通式如下：
α，β，γ- 环糊精的结构及羟基分布如图6-2-2 所示。其中以β-CD应用最为广泛，δ-CD 包合能力低较少使用。在β-CD主体分子中各个葡萄糖分子皆处于椅式构象，锥体外侧边框连有大量羟基而呈亲水性；在葡萄糖分子中，与2、3 位碳原子连接的羟基位于锥体窄端的外边缘（主要羟基边），与6位碳原子连接的羟基位于锥体宽端的外边缘（次要羟基边）。在锥体内部空腔处于—CH2基团的屏蔽之下而呈疏水性。当客体分子进入β-CD 的空穴，就形成具有特效亲和作用的包合配合物。含β-CD 配位体的亲和色谱固定相已用于旋光异构体（左旋和右旋的药物分子或生物分子）、空间异构体（顺式和反式）和同分异构体（正构和异构）的分离。
（2）冠醚和穴醚
①冠醚 冠醚（Crown Ether）是由+ 原子和含配位电子的原子，如氧、氮、硫、磷、砷等元素，构成的环状主体化合物。其中的杂原子提供了富电子环境，可与进入冠醚的客体金属离子以配价键相结合，构成形状似王冠状的包合配合物，所以将此类主体化合物称作冠醚。金属离子K+与1，4，7，10，13，16- 六氧杂环十八烷（简称18- 冠 -6 形成包合配合物的结构如下：
②穴醚穴醚（Cryrand）是在冠醚基体上形成的双环配位体，它比冠醚具有更强的络合能力。穴醚上有两个 N 原子作为分子中形成三支醚链的桥头原子，氮原子上的孤对电子可处于面向环内的内向构象和面向环外的外向构象。金属离子K+与4，7，13，16，21，24- 六氧杂 -1，10 - 二氮杂双环 - 二十六烷形成的包合配合物的结构如下：
冠醚和穴醚化合物作为亲和色谱固定相的配位体，可作为模拟酶的主体化合物，来研究与客体生物分子的相互作用。
（3）杯环芳烃
一类杯环芳烃是由对位取代苯酚与甲醛进行缩合反应获得的低聚物（称Calixarene），反应式，化学结构及立体结构如下：
缩合苯酚环的个数n=4-8，可构成内径不同的倒置杯状物。苯酚环是由亚甲基桥连接形成具有独特空穴结构的大环化合物主体分子，其内腔为疏水的苯环，羟基在杯环物直径小的一端，取代基 R 在直径大的一端，可为酯、酮、酰胺、烷基吡啶等官能团。杯环芳烃与客体分子之间存在的特效亲和作用使它们构成非离子型或离子型包合配合物。另一类杯环芳烃是由间苯二酚（及其衍生物）与甲醛（或芳醛）在酸催化下缩合而成的低聚物（称Resorcarence）。它的杯环状结构可在一定条件下转变成椅式结构。此类杯环芳烃的化学结构、立体结构和构象变化如下：
杯环芳烃也已作为亲和色谱固定相的配位体和模拟酶的主体，研究它们与客体手性药物或手性氨基酸及其衍生物的相互作用。前述β-CD、冠醚、杯环芳烃与基体的键合过程可参阅下述实例。
例一，苯磺酰化β-CD 与氨丙基硅烷化的活性硅胶的键合反应，如下：
此亲和色谱固定相已用于脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及组氨酸的分离。
例二，4，4'- 二氨基二苯并18- 冠 -6 与氯甲基化苯乙烯 - 二乙烯基苯共聚物的键合反应过程如下：
此亲和色谱固定相可作为模拟酶的主体化合物，研究它与客体生物分子的相互作用。例三，将 P- 烯丙基 - Calix[4]arene 四乙酸酯键合在硅胶的反应如下：
此亲和色谱固定相已用于分离六种氨基酸酯的盐酸盐。
4. 生物特效配位体
生物特效亲和色谱是利用生物活性物质分子之间存在的可逆的、特效的相互作用。对于酶配位体是依据它们对其底物、效应物（激活物或抑制物）、辅助因子或具有适当官能团分子的天然亲和能力。生物大分子之间的可逆、特效的亲和能力，是由于它们在形成亲和作用区间内基团的化学结构、立体排布，而表现出具有轮廓分明的嵌镶结构特征，从而呈现出在一部分分子间或分子中某个部分的生物识别能力。
作为生物特效配位体（Bio - Speccific Liqand）的生物活性物质，可为氨基酸、肽、抗体、抗原、蛋白质；核碱、核苷、核苷酸、寡聚核苷酸、辅酶（A、Ⅰ、Ⅱ、B12）、核糖核酸与脱氧核糖核酸，以及微生物细胞等多种生物小分子或大分子；还可是能与生物活性分子发生作用的化学药物，如阿普洛尔、四氢大麻酚、氨甲蝶呤、17β- 雌二醇、乙炔基甾体等。生物特效配位体在生物分子的分离、纯化中发挥着极其重要的作用，它是亲和色谱法中的一个主要组成部分。胞嘧啶核苷酸（CMP）在已活化的氨丙基硅胶上的键合反应如下：
EDAC：二甲基氨丙基乙基碳化二胺盐酸盐，水溶性偶联剂。
由无定形多晶硅粒（或硅胶）键合CMP配位体制成的亲和色谱固定相，已用于细胞色素C、核糖核酸酶、溶菌酶、纤维素酶、肌酸激酶、乳酸脱氨酶、牛血清蛋白、牛血红蛋白等多种蛋白质的纯度分析。
辅酶 Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称NPD）为多种脱氢酶的辅酶，它与活化后的氨丙基硅胶的键合反应如下：
5. 电荷转移配位体
当两种有机化合物之间，有一个电子从一个化合物转移到另一个化合物时，它们之间就由于相互静电吸引的亲和作用，而形成电荷转移络合物。此时能给出电子的化合物称作电子给予体（Electrondonor），接受电子的化合物称作电子接受体（Electron Accepter）。电荷转移配位体（Charge Transfer Ligand）可以是电子给予体，也可以是电子接受体。2，4 , 二硝基苯 - 硅胶固定相与色氨酸分子间的电荷转移作用，如图6-2-3 所示。
电子给予体和电子接受体性质的定量分类，是用由薛定谔方程式的一个近似解所决定的能量本征值（energy eigenvalues）K 来表达的，分子轨道 j 的电子能量 Ej
式中，α为库仑积分，β为交换积分（为负值）。
图6-2-4表示在电荷转移色谱中一些化合物的能量本征值Kj，在最高占有分子轨道中的电子具有小的Kj值，如核苷酸，表明它为好的电子给予体；在最低空分子轨道的电子具有小的Kj值（绝对值），如苯醌，表明它为好的电子接受体。
对同一种有机化合物，其电子给予和电子接受能力具有相对性，若呈现强的电子给予体的能力，与此同时，必定具有弱的电子接受体的能力。
将5，10，15，20- 四（对羟基苯基）卟啉（THPP）键合在已活化的氨丙基硅胶上，制成具有电子给予体功能的亲和色谱固定相的反应如下：
此固定相已用于具有电子接受能力的核苷或核苷酸的分离。
将磺酰化酞菁铜键合在已活化的氨丙基硅胶上，制成具有电子接受体功能的亲和色谱固定相的反应如下：
此固定相已用于具有电子给予能力的核碱（Cyt，Ura，Thy，Ade，Hyp）及核苷（C，U，T）的分离。
6. 共价配位体
共价配位是一种特殊的生物选择性吸附作用。它利用含二硫桥键（—S—S—）的吸附剂与含巯基的生物活性分子共价结合。在较温和的反应条件下此共价结合反应是可逆的，可用于含硫蛋白质的分离。在琼脂糖基体上键合谷胱甘肽-2- 吡啶二硫化物共价配位体（Covalent Ligand），构成亲和色谱固定相，然后用于分析含硫蛋白质（如木瓜蛋白，R—SH）。共价键合的蛋白质可用流基乙醇（R'-SH）或半胱氨酸洗脱，最后再用2 - 吡啶二硫化物对固定相进行再生。此固定相可反复使用。全部反应过程如下：
上述共价配位亲和色谱固定相多用于含硫蛋白质的纯化制备。
流动相
在亲和色谱分析中，分离、纯化的对象皆为氨基酸、多肽、蛋白质、核碱、核苷、核苷酸、寡聚和多聚核苷酸、核糖核酸、脱氧核糖核酸以及酶、辅酶、寡糖、多糖等生物分子，其中大多数为极性化合物，不少还具有生物活性。因此，当从固定相上将它们洗脱下来时，需使用pH值接近于中性的稀缓冲溶液，以在比较温和的洗脱条件下，保持其生物活性。
此外，在亲和色谱分离原理中已经指出，生物分子与各种亲和配位体生成络合物的稳定常数较小，皆为可逆络合物，在大多数情况下，可使用非选择性洗脱法，实现不同组分的分离。对形成锁匙结构后，亲和作用特别强的情况，必须采用特效性洗脱法或特殊洗脱方法，即使用含有特定组分、具有超强洗脱能力的流动相进行洗脱。
（一）缓冲溶液流动相的组成
亲和色谱分析使用的流动相，主要是由磷酸盐、硼酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐构成的具有不同pH值的缓冲溶液体系，有机碱三羟甲基氨基甲烷（Trihydroxymethl Aminomethance，简称Tris）与盐酸、顺丁烯二酸构成的缓冲溶液体系也获较多使用。常用的缓冲溶液组成见表6-2-8。
表 6-2-8 常用的不同pH值缓冲溶液的组成(http://www.chemalink.net/books/C/579/0.html)
此外在生物大分子亲和色谱分析中还广泛使用生物研究中常用的氢离子缓冲物（Good's buffers），如HEPES（N-(2- ）羟乙基）- n -（2 - 磺化乙基）- 哌嗪、TEEN（N，N，N'，N' - 四乙基乙二胺）等。
（二）洗脱方法
1. 非选择性洗脱法
当被分离的生物分子与配位体形成稳定常数较小的络合物时，在恒组成洗脱条件下，使用洗脱能力较弱的、具有不同pH值的缓冲溶液，就可使络合物解离，而将被分析的生物分子洗脱下来。当被分离的生物分子除与配位体存在络合作用外，还存在由于静电吸引力、氢键力、或疏水相互作用力引起的非特异性吸附作用时，必须通过以下几种方法来消除非特异性吸附作用，以达到既能消除生物分子与固定相（配位体或间隔臂）的非特异性吸附，又不损害生物分子的生物活性和固定相的稳定性。
（1）改变流动相的pH值如胰蛋白酶在Sephose - 大豆胰蛋白酶抑制剂固定相上，使用pH=8.1 的流动相不能洗脱下来，若改用"# , /.! 的流动相就可顺利洗脱下来。由于有许多类型的亲和作用会在极端的pH值（极低或极高）时被破坏，因此当利用改变pH值法来变更洗脱条件时，应注意样品分子是否会失去生物活性，是否能耐受剧烈变化的变性（denaturation）条件，否则应寻找其他洗脱方法，以保持样品分子的生物活性。
（2）改变流动相的离子强度任何具有离子基团的亲和色谱固定相，都会由于产生非特异性吸附作用，而影响蛋白质的洗脱。如用ε- 氨基己酸作间隔臂偶联苯甲脒配位体的生物特效亲和色谱固定相，来分离带有正电荷的胰蛋白酶时， ε- 氨基己酸残存的羧基负离子会与样品分子产生静电吸引的非特异性相互作用，如图6 - 2 -5 所示。此时可向流动相中加入0.1-1.0mol/L 高浓度NaCl溶液，来增加流动相的离子强度，以减轻上述非特异性相互作用，而实现样品分子的顺利洗脱。此时也可采用梯度洗脱方式进行。
（3）改变流动相的极性向具有一定pH值的流动相中加入极少量的有机改性剂，如甲醇、乙腈、对二氧六环、四氢呋喃、乙二醇、二甲基甲酰胺等，此时因改变了亲和作用周围的介质条件，会随着疏水作用的增强，而破坏样品分子与配位基间的亲和作用，呈现出极有效的洗脱效应。此时也可采用梯度洗脱方式进行，但也应注意有机溶剂的副作用，它会使蛋白质结构改变而发生变性，当除去有机溶剂后，会恢复蛋白质的天然
结构而使其活性复原。
（4）加入离液序列试剂（Chaotropic Agents） 如将硫氰化钾、脲、盐酸胍、三氯乙酸等离液序列试剂加入到流动相中，会使蛋白质等生物分子的结构发生变化，而破坏原已存在的亲和作用。此类物质实际上就是蛋白质的变性剂。当使用低浓度（10mmol/L左右）离液序列试剂时，是实现快速洗脱，并尽可能保持生物分子生物活性的最佳方法。此方法已在免疫亲和色谱和血液中蛋白质的分离方面获得应用。
上述非选择性洗脱法的最大优点是使用了廉价的pH缓冲溶液作为流动相，此外还可克服溶质解吸过程的动力学限制。并可作为取代特效性洗脱法的有效措施。
非选择性洗脱法的缺点，是当使用有机改性剂或离液序列试剂来强化洗脱条件时，常会使被分离生物分子的结构发生不可逆变化。尤其当分离具有高活性的蛋白质时，应慎重使用。
2. 特效性洗脱法
在生物特效亲和色谱分析中，当生物分子与固定相的配位体存在强的亲和作用时，应采用选择性强的特效性洗脱法。此时存在于流动相中存在的另一种游离的配位基可以取代固定相上的配位体，并与被分离的生物分子相结合而从柱中洗脱出来。洗脱后可利用改变pH值或加入变性剂的方法，重新获得生物分子的纯品。
如在键合一磷酸腺苷（AMP）配位体的固定相上，乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶皆不能用含0.5mmol/L NAD 的流动相洗脱下来，但当用含 3mmol/L 羟胺的上述流动相时，就可特效性地将乙醇脱氢酶洗脱下来。相似地，另用含 5mmol/L 丙酮酸的上述流动相，也可特效性地将乳酸脱氢酶洗脱下来。
为提高特效性洗脱的纯化效果，在洗脱方法上可采用多次脉冲式加入流动相的方法进行，或采用停流洗脱方式，以增加流动相与样品分子的相互作用时间。停流时间的长短是由络合物的离解常数和离解过程的动力学过程决定的，若离解常数愈小，离解过程的速度愈慢，则停流的时间愈长，洗脱量也愈大，可以保证洗脱完全。
由上述可知，生物特效性洗脱技术和条件的选择，即依赖于分离的目的，也依赖于影响生物特效性亲和作用的热力学和动力学过程的各种因素。
