Cell Counting Kit-8

Cat #:GK3607-100T/ GK3607-500T

一、试剂盒组成、规格、储存：

成分       100T               500T                       储存

CCK-8 溶液       1ml                   5ml                  4℃或-20℃

二、产品简介：

Cell Counting Kit-8 简称 CCK-8，是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速 高灵敏度检测试剂盒。CCK-8 基于 WST-8，与 MTT 类似，在电子耦合试剂存在的 情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的 formazan。对于同样的细 胞，颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在 450nm 波 长处测定 OD 值，间接反映活细胞数量。

CCK-8 试剂盒可用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验 以及生物因子的活性检测等。酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。CCK-8 对 细胞无明显毒性。加入 CCK-8 显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测 时间更加灵活，便于找到最佳测定时间。

三、CCK-8 优势：

1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；

2、能快速检测；

3、检测灵敏度很高；

4、重复性优于 MTT 法；

5、对细胞毒性小；

6、即用型溶液，无需配置，使用方便。

四、使用方法（仅供参考）： 

实验一：细胞活性检测

1、制备细胞悬液：胰蛋白酶消化成单个细胞，计数。

2、细胞接种：根据不同细胞特性，取合适的细胞数铺于 96 孔板，每孔约 100ul 细胞 悬液。将培养板放在培养箱中预培养。

3、向每孔加入 10μl CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成气泡，会影响 OD 值的读数）。

4、将培养板在培养箱内孵育 1-4h。

5、用酶标仪测定在 450nm 处的吸光值。

实验二：细胞增殖分析

1、制备细胞悬液：胰蛋白酶消化成单个细胞，计数。

2、细胞接种：根据不同细胞特性，取合适的细胞数铺于 96 孔板，每孔约 100ul 细胞 悬液。

3、CO2 培养箱中培养：细胞接种后培养 4-8h，如果不需要贴壁，这步可以省去。

4、加入 10ul CCK-8：由于每孔加入 CCK-8 量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而 带来误差，建议在加完试剂后轻轻振板几次以帮助混匀。或者直接配置含 10% CCK-8 的培养基，以换液的形式加入。

5、培养 1-4h：:细胞种类不同，形成的 formazan 的量也不一样。如果显色不够，可 以继续培养，以确认最佳条件。一般 OD 值在 1 左右较好，最大不超过 2。

6、在 450nm 测定吸光度。如无 450nm 滤光片，可以使用 420-480nm 的滤光片。可 以使用大于 600nm 的波长，例如 650nm，作为参考波长进行双波长测定。

实验三：细胞毒性分析

1、制备细胞悬液：胰蛋白酶消化成单个细胞，计数。

2、细胞接种：根据不同细胞特性，取合适的细胞数铺于 96 孔板，每孔约 100ul 细胞 悬液。

3、CO2 培养箱中培养：细胞接种后培养 4-8h，如果不需要贴壁，这步可以省去。

4、加入不同浓度的毒性物质。

5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏 感性，一般要根据细胞周期来决定，至少要一代以上的时间。

6、加入 10ul CCK-8：由于每孔加入 CCK-8 量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而 带来误差，建议在加完试剂后轻轻振板几次以帮助混匀。或者直接配置含 10% CCK-8 的培养基，以换液的形式加入。

7、培养 1-4h：:细胞种类不同，形成的甲臜的量也不一样。如果显色不够，可以继续 培养，以确认最佳条件。一般 OD 值在 1 左右较好，最大不超过 2。

8、在 450nm 测定吸光度。如无 450nm 滤光片，可以使用 420-480nm 的滤光片。可 以使用大于 600nm 的波长，例如 650nm，作为参考波长进行双波长测定。

注：

若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10μl 0.1M 的 HCl 溶液或者 1% SDS 溶 液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化。 

五、储存条件

4℃避光保存 1 年，-20℃避光保存 2 年。

六、注意事项

1、使用标准 96 孔板时，通常细胞增殖实验每孔加入 2,000 个细胞/100ul 培养基，细 胞毒性实验每孔加入 5,000 个细胞/100ul 培养基(具体每孔所用的细胞的数目，需 根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定)。按照实验需要，进行培养并 给予 0-10ul 特定的药物刺激。

2、酚红和血清对 CCK-8 法的检测不会造成干扰，可以通过减去空白孔中本底的吸光 度而消除。

3、CCK-8 试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生 漏加或多加。

4、CCK-8 可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过 程中需要避免细菌污染，以免影响结果

5、当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔容易干燥挥发，导致体积不准确而增 加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。

6、在培养基中加入 CCK-8，培养一定的时间，测定 450nm 的吸光度即为空白对照。 在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入 CCK-8， 培养一定的时间，测定 450nm 的吸光度作为空白对照。

7、金属对 CCK-8 显色有影响：终浓度为 1mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会 5%、

15%、90%的抑制显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是 10mM，将会 100%抑 制显色反应。

8、部分悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量并延长培养时间。