一、试剂盒组成、规格、储存：
 

二、产品简介：

       活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜 ，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。在激发波长502nm，发射波长530nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪 、流式细胞仪等检测DCF荧光，从而测定细胞内活性氧水平。

      本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂，以便于活性氧检测。DCFH-DA 检测系统本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。

      本试剂盒可以测定 100-500 个样品。

三、实验前试剂准备：

1、推荐 CDFH-DA 1:1000 稀释即初始工作浓度为 10μM。针对不同的细胞和刺激， CDFH-DA 有效工作浓度可在 100nM-20μM 宽范围内变动，因此需要进行预实验 确定合适浓度。

2、CDFH-DA 可稀释于培养基或缓冲液中。但如果培养基颜色或血清干扰荧光测定， 需将 CDFH-DA 稀释于无酚红无血清培养基或适宜的缓冲液如 PBS 中。

3、活性氧阳性对照的工作浓度约为 100μM，超过 200μM 将产生细胞毒性。

四、储存条件：

DCFH-DA (10mM)，-20℃保存。活性氧阳性对照，4℃保存。用前 1:1000-1:10000

倍稀释。一年有效。

五、使用方法（仅供参考）：

1、装载荧光探针：

原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照 1:1000 用无血清培养液稀释

DCFH-DA，使终浓度为 10μM。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的 DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入 稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。37℃细胞培养箱内孵育 20min 至几个小时（根 据不同细胞调整）。无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内 的 DCFH-DA。

收集细胞后装载探针：按照 1:1000 用无血清培养液稀释 DCFH-DA，使终浓度为10μM。细胞收集后悬浮于稀释好的 DCFH-DA 中，细胞浓度为一百万至二千万

/ml，37℃细胞培养箱内孵育 20min 几个小时（根据不同细胞调整）。每隔 3-5min 颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以 充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。 如果检测药物处理对细胞内活性氧的影响，药物刺激时间较短（2h 以内）或效应 较弱的细胞，可先加或同时加入 DCFH-DA，后用活性氧阳性对照或目标药物 刺激细胞。反之，刺激时间较长（6h 以内）或效应较强的细胞，应该后加 DCFH-DA。

2、检测：

对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或集细胞后用荧光 分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可 以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接 观察也可以。

六、注意事项：

1、装载后定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2、装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确 认探针的装载情况是否良好。

3、缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。

4、使用前请低速离心。