仪器简介：双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其频率可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

技术指标：8根激光器，其中可见光5根有458nm/488nm/514nm,543nm/561/nm,594nm,633nm，不可见光3根有405nm，445nm和680-1064nm。

技术参数：（1）检测器 LSM 880 with fast Airyscan技术同时拥有快速的超高分辨率成像，以及高灵敏度的图像采集。这种新型检测器设计优良，即使是厚样本也能获得分辨率为120nm（ x， y）和350nm（ z）的一个完美的光学切面，并能将信噪比（ SNR）提升4–8倍。在您进行单光子或多光子实验时，使用这种新颖的探测器设计获得更高的灵敏度，分辨率和速度；同时还配备有内置2PMT、1  

GaAsP检测器、1个T-PMT检测器。

（2）观察方式 明场、微分干涉（DIC）、相差、荧光

（3）激光器

适用于从690-1080的波长范围连续可调的脉冲式超快红外双光子激光器；Z1 固体激光器 (405nm，30mW) 多谱线氩离子激光器 (458nm/488nm/514nm，25mW) 固体激光器 (561nm，20mW) 氦氖激光器 （594nm/633nm，5mW)

（4）显微镜主机 Axio Examiner的正置显微镜，活体显微检测平台，大样品操作空间能够满足多种需求

主要功能：LSM710 NLO集合了单光子激光共聚焦显微技术及双光子显微激发技术，是一种先进的分子生物学和细胞生物学研究仪器,主要用于检测各种染色，非染色和荧光标记的细胞或组织，可进行细胞结构或组分的定位定性和定量分析等，是形态学、分子细胞生物学、神经科学、和药理学等研究领域中重要的研究手段。

服务内容：双光子成像-Zeiss 710 NLO,单双光子-Zeiss 710 NLO,激光共聚焦-Zeiss 710 NLO

应用范围：

（1）三维重建（3D Reconstruction）：对样品进行连续扫描，根据薄层光学切片获得三维数据，通过三维重建直观地进行观察。

（2）多荧光标记分析（Multifluorescence）：对单荧光和多荧光标记的样品进行高清晰和高分辨率的扫描并采集图像。

（3）共定位（Co-localization）：对样品内两种荧光标记的信号共同分布的位置进行分析。

（4）动物活体成像：电生理显微镜以及双光子可实现对动物组织如脑的活体成像。

（5）光谱拆分：分离串色荧光信号和自发荧光。

（6）生理学测量功能（Physiology）：对细胞内重要离子浓度和pH值的测定。（7）荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）：测量荧光标记分子间的相互作用。

（8）光漂白恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP）：将荧光标记分子用激光照射漂白后观察其荧光恢复情况，可用来测量荧光标记分子的运动和扩散。

（9）超高分辨率成像：使用Airyscan检测器能获得分辨率为120nm（ x， y）和350nm（ z）的一个完美的光学切面。

服务特点：

1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；

2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；

3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；

4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。

样品要求：

玻片样本包括组织切片或细胞染色爬片、所有适合配置激光器激发的荧光样品都可以进行超高分辨率成像，无需选择特定的荧光染料，可以做动物活体实验